图 ! !"#牛溶浆机胰核糖核酸酶分子的变性与复性 ##变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，但变性蛋白质容易沉淀，凝固的蛋白质均已变性，而且不再溶解。 ##（四）蛋白质的光谱吸收与呈色反应 # #$%蛋白质的光谱吸收 ##组成蛋白质的肽键和侧链上的某些基团对一定波长的光有其特征性的吸收峰。色氨酸残基和酪氨酸残基含有共轭双键，使蛋白质在波长 !&’ ()紫外光下有最大吸收峰。 !&’ ()处吸光度的测定常用于蛋白质的定量。 # #!%蛋白质的呈色反应 ##蛋白质分子中的肽键和许多侧链基团均可与一些特定的试剂发生呈色反应。这些呈色反应常用于蛋白质的定性与定量。二缩脲反应（*+,-./ /.0/）的原理是，在碱性溶液中， 1,! 2可与蛋白质分子中肽键形成紫红色络合物。二缩脲反应对蛋白质的检出量为 $ 3!’ )4。酚试剂呈色反应是最为常用的蛋白质定量方法（又称 567-8法）。此法除蛋白质分子中肽键与碱性铜发生二缩脲反应外，蛋白质分子中的色氨酸与酪氨酸残基还将试剂中的磷钨酸和磷钼酸盐还原生成蓝色化合物（钼蓝）。酚试剂法很灵敏，可检测出 9 !4的蛋白质。二、蛋白质的提取与纯化原理 ##破碎组织和细胞，将蛋白质溶解于溶液中的过程称为蛋白质的提取，将溶
液中的蛋白质相互分离而取得单一蛋白质组分的过程称为蛋白质的纯化。蛋白质的各种理化性质和生物学性质是其提取与纯化的依据。目前尚无单一的方法可纯化出所有的蛋白质，每一蛋白质的纯化过程常是许多方法综合应用的系列过程。纯化蛋白质的常用方法列于表 !&。 ##（一）改变蛋白质的溶解度 ##通过改变蛋白质的溶解度沉淀蛋白质的常用方法有盐析和有机溶剂沉淀。此外，还有调节 :;和改变温度等方法。 第二章 #蛋#白#质"!表 ! "#蛋白质的理化性质与常用的纯化方法蛋白质的理化性质常用的纯化方法分子质量与体积离心凝胶过滤透析、超滤电荷离子交换层析电泳等电聚焦溶解度调整 !"调整离子强度降低介电常数特异结合部位亲和层析亲和洗脱其他性质吸附层析液相层析气相层析 ##盐析（$%&’()* +,’）是用高浓度的中性盐将蛋白质从溶液中析出的方法。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。高浓度的中性盐可以夺取蛋白质周围的水化膜，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性。对不同的蛋白质进行盐析时，需要采用不同的盐浓度和不同的 !"。盐析时的 !"多选择在蛋白质的等电点附近。例如，在 !"-. /附近时，血清清蛋白溶于半饱和硫酸铵中，球蛋白沉淀下来；当硫酸铵达到饱和浓度时，清蛋白也沉淀出来。 ##与水互溶的有机溶剂（丙酮、正丁醇、乙醇和甲醇等）可以显著降低溶液的介电常数，使蛋白质分子之间相互吸引而沉淀。有机溶剂沉淀蛋白质应在低温下进行，低温不仅降低蛋白质的溶解度，而且还可以减少蛋白质变性的机会。 ##（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法 ##各种蛋白质分子具有不同的相对分子质量和形状，可采用离心、超滤和凝胶过滤等技术将其分离。 # #0.离心 ##离心（12)’3(4,*%’(+)）分离是利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。按应用
实际，离心机可分为制备型离心机（!32!%3%’(52 $1%&2 12)’3(4,*2）和分析型离心机（%)%&6’(1%& 12)7 ’3(4,*2）。 ##制备型离心用于大量样品的分离。例如，差速离心（8(44232)’(%& 12)’3(4,*%’(+)）是对含两种以上大小不同的待分离物质的混合液，以不同离心速率分步骤离心沉淀，使之相互分离的离心方法。图 9 9-显示利用差速离心法分离不同的亚细胞结构。由图可见，不同的亚细胞组分可以用不同的离心力，分级的逐步沉淀分离出来。 ##分析型超速离心可用来测定蛋白质的相对分子质量。蛋白质在高达 :/ ///; !的离心力下，可在溶液中逐渐沉降，直到溶液对其浮力（<,+6%)’ 4+312）与离心力相等时便停止沉降。已知，在离心过程中作用于溶质分子上的离心力为 !9 "，其中 !是离心角速率， "是溶质离开中心轴的距离。当溶质在离心力场中运动达到离心稳态时，溶质分子所受的离心力与反方向的阻力（摩擦力和黏滞阻力）相平衡，此时溶质便以恒速沉降。在单位离心力场下，溶质分子的沉降速率为： 8" !9 "·# = 8$ "!第一篇(生物分子的结构与功能匀浆 $$$! """ # !，$ %&’ $$$$$$%%%%%%%%%%%%%## (沉淀上清 ) """ # !，!" %&’ $$$$$$（未破坏的%%%%%%%%$$$%%%%真核细胞） ## (沉淀上清
